Register now or log in to join your professional community.
تم استخلاص وتنقية البروتين المرتبط بالفايبرونكتين من الجدار الخلوي لبكتريا المكورات العنقودية الذهبية ( Staphylococcus aureus). اذ انتخبت 6 عزلات بكتيرية من مجموع ( ) عزلة تم الحصول عليها من مختبرات مدينة الطب ، ومختبر الصحة العامة وقسم التقنيات الأحيائية في كلية العلوم / جامعة بغداد ، وأجريت على هذه العزلات كافة الاختبارات التشخيصية والتأكيدية لغرض التأكد من نقاوتها وقدرتها على انتاج البروتين المرتبط بالفايبرونكتين.
استخلص البروتين بنبذ العالق البكتيري في جهاز المنبذة المبردة ( Cooling centrifuge) و تكسير الخلايا البكترية بالموجات فوق الصوتية بوساطة جهاز التكسير الكهربائي ( Sonicator ) ، ركز المستخلص البروتيني بوساطة كبريتات الأمونيوم ومن ثم بعملية الديلزة والترشيح الفائق لغرض التخلص من أكبر نسبة ممكنة من الأملاح والشوائب الموجودة في المحلول .
نقي المستخلص البروتيني بوساطة كروموتوغرافيا الترشيح الهلامي على عمود هلام السيفاكريل S- إذ انفصلت قمتان بعد قراءة المستخلص الناتج على طول موجي نانوميتر ، تم التأكد من نقاوة بروتين الالتصاق السطحي وذلك بظهور حزمة واحدة عند أجراء الترحيل الكهربائي في هلام الاكريل امايد المتعدد بوجود المواد الماسخة SDS . وبينت نتائج توصيف البروتين إن الوزن الجزيئي بطريقة الترشيح الهلامي و الترحيل الكهربائي على هلام الاكريل امايد المتعدد وبوجود المواد الماسخة للبروتين SDS ومركبتوايثانول فقد قدر الوزن الجزيئي في هذه الحالة بمقدار (0 ) و (0 ) دالتون وتبين من خلال مطابقة الوزن الجزيئي للبروتين مع الاوزان الجزيئية للبروتينات القياسية ان البروتين هو البروتين المرتبط بالفايبرونكتين .
الفصل الكهربائي - الكروماتوجرافي
كروماتوغرافي CMS HPLC...إلخالفصل اعتمادا على الشحنة electrophoresisالفصل عن طريق تقنية Immunoassays وهي من أحدث الطرق وأسرعها والأكثر استعمالا للتحليل الأولي.
يتم استخراج البروتينات وتنقيتها باستخدام dialysis حيث ان هذه العملية تزيل جميع الاملاح عن البروتينات .
1-من خلال جهاز عالية الأداء اللوني السائل (HPLC )
2- من خلال جهاز الترحيل الكهربائي
يجب وضع البروتين في محلول عن طريق تحطيم النسيج أو الخلايا الحاوية له، اعتماداً على مصدره. هناك عدة طرق لتحقيق ذلك: التجميد والتذويب المتكرر والصوتنة والمجانسة عن طريق الضغط العالي والترشيح وجعله نفوذا عن طريق المذيبات العضوية. تعتمد الطريقة المختارة على هشاشة البروتين ومدى تجلّد الخلايا. عادة وفي معظم الطرق المتعارف عليها، تستخدم كروماتوغرافيا العمود لتحقيق التنقية. بعد عملية الاستخلاص هذه تصبح البروتينات الذوابة في المذيب، ويمكن فصلها عن الغشاء الخلوي و دي إن أي إلخ. عن طريق الطرد المركزي. عملية الاستخلاص تستخلص أيضاً الببتيداز، والذي يبدأ بهضم البروتين في المحلول. عادة إن كان البروتين حساس للتحلل البروتيني، فمن المفضل العمل بسرعة وإبقاء المستخلص بارداً، لإبطاء التحلل البروتيني.
ادة ما تستفيد التنقية التحليلية من ثلاث خواص لفصل البروتين. الأولى، يمكن تنقية البروتين اعتماداً على نقطة التساوي الكهربي وذلك بتمريره بعمود هلام pH مدرج (pH graded gel) أو عمود تبادل أيوني. ثانياً، يمكن فصل البروتينات اعتماداً على حجمها أو كتلتها الجزيئية عن طريق كروماتوغرافيا الإقصاء الحجمي أو تحليل إس دي إس بايج (SDS-PAGE - الفصل الكهربائي لهلام كبريتات دوديكل الصوديوم متعددالأكريلامايد). عادة ما تنقى البروتينات باستخدام 2D-PAGE (الفصل الكهربائي لهلام ثنائي الأبعاد) وبعدها يحلل عن طريق بصمة كتلة الببتيد (Peptide mass fingerprinting) لإثبات هوية البروتين. وهذا مفيد جداً للأغراض العلمية إذ يكفي في هذه الأيام بعض النانو-غرامات من البروتين لتحليلها. ثالثاً، يمكن فصل البروتينات عن طريق القطبية/كراهية الماء باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء أو كروماتوغرافيا الطور المعكوس.
تتضمن إجرائيات تنقية البروتين عادة خطوة كروماتوغرافية أو أكثر. الإجراء البسيط في الكروماتوغرافيا هي ضخ محلول يحوي البروتين في عمود محشو بمواد مختلفة. حيث تتأثر البروتينات المختلفة مع مواد العمود بشكل مختلف، وبذلك يمكن فصلها بالوقت اللازم للمرور بالعمود، أو الشروط المطلوبة لاستخلاص البروتين من العمود. عادة ما يكشف عن البروتينات أثناء خروجها من العمود بامتصاصها عند 280 نانو-متر. ويوجد عدة طرق كروماتوغرافية مختلفة
يمكن استخدام الكروموتوغرافيا لفصل بروتين في محلول أو ظروف افساد باستخدام هلام مسامي. تعرف هذه التقنية بكروموتوغرافيا الإقصاء الحجمي. مبدأها أن الجزيئات الأصغر عليها أن تعبر حجماً أكبر في النسيج المسامي. لذا ستحتاج البروتينات ذات القياسات المختلفة إلى كمية مختلفة من الشاطِف (المذيب) قبل أن تصل إلى الطرف الآخر من عمود الهلام وتجمع من هناك.
عند الحديث عن تنقية البروتينات، فعادة ما يجمّع الشاطف في أنابيب اختبار مختلفة. ويتم إهمال كل أنابيب الاختبار التي لا يوجد فيها أثر قابل للقياس من البروتين المطلوب. المحلول المتبقي يحوي البروتين المطلوب تنقيته، إضافة إلى بروتينات أخرى ذات حجم مشابه.
الترشيح الكهربائي اليكتروفورسيس
الكروموتوغرافيا
